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完整的转录本包括了从5’端到3’端polyA尾的序列，长度集中分布在1-6kb。二代测序技术由于读长较短，得到的测序片段需要拼接，得到的转录本可能会产生拼接错误和较多的嵌合体，从而不能得到完整的转录本。第三代测序技术Pacbio利用单分子实时测序技术（SMRT），由于其超长的读长（平均15kb），无需拼接即可直接获取完整的全长转录本，因此可得到更高质量的转录本，有利于mRNA结构的研究，如可变剪切、融合基因、等位基因表达等。因此，全长转录本的研究越来越热门，发表的文章影响因子也比简单用二代测序RNA-seq要高。

目前第三代测序仪器最主要是美国太平洋生物技术公司（Pacific Biosciences）SequelⅡ。SequelⅡ是基于单分子实时测序技术的最新测序皇冠hg会员登录首页，通量更高，准确度可达99.9%，测序成本更低，项目周期更短。

应用领域

1. 获取无参考基因组物种较完整的参考编码序列

2. 不同实验处理后引起的可变剪切事件变化

3. 更准确的定量分析

技术路线

分析内容

1. 标准信息分析

1.1原始测序数据统计及质控

1.2Reads分类

1.3 Reads聚类和校正

1.4全长isoform数据统计

1.5 基因基本功能注释

a) Nr注释

b) GO功能注释

c) COG/KOG注释

d) KEGG代谢通路注释

e) SwissProt蛋白注释

1.6基因高级功能注释

a) 预测编码蛋白框（CDS）

b) 转录因子分析

c) R基因分析（植物）

d) 蛋白结构域分析（Pfam, SMART）

e) TMHMM跨膜螺旋结构预测

f) SignalP信号肽结构预测

g) 蛋白O-GlcNAc糖基化位点预测（哺乳动物）

h) ProP弗林蛋白酶裂解位点预测（真核生物）

1.7结构分析

a) 串联重复单元检测（SSR）

b) lncRNA分析

c) 可变剪切分析

2. 定制化信息分析

a) 二代数据校正三代数据（需有Illumina数据）

b) 基因定量及差异表达分析（需有Illumina数据）

c) 多组学关联分析（如甲基化、蛋白组、miRNA）

样品要求/项目周期

请咨询当地销售或拨打电话：020-84889324（医学）、020-84889314（农学）了解详情。

参考文献

[1] Li J , Haratalee Y , MD Denton, et al. Long read reference genome-free reconstruction of a full-length transcriptome from Astragalus membranaceus reveals transcript variants involved in bioactive compound biosynthesis.[J]. Cell Discovery, 2017, 3:17031.

[2] Mi K , Jae-Sung R , Tae K , et al. Alternative Splicing Profile and Sex-Preferential Gene Expression in the Female and Male Pacific Abalone Haliotis discus hannai[J]. Genes, 2017, 8(3):99-.

[3] Liu X , Mei W , Soltis P S , et al. Detecting alternatively spliced transcript isoforms from single‐molecule long‐read sequences without a reference genome[J]. Molecular Ecology Resources, 2017, 17(6).

[4] Wenger, A. M., et al. Accurate Circular Consensus Long-read Sequencing Improves Variant Detection and Assembly of a Human Genome. Nature Biotechnology, 2019, 37, 1155–1162.

Q1：有参三代全长转录组和无参三代全长转录组的分析内容各有哪些？

A：1. 有参三代全长转录组分析内容：可变剪接、可变多聚腺苷酸化、融合基因、LncRNA分析、开放阅读框分析、TF分析、SNP/Indel分析、基因结构优化；

2. 无参三代全长转录组分析内容：

a) 基本注释：NR、SwissProt、KEGG 和 COG/KOG、GO等数据库的注释

b) 高级注释：CDS预测、Pfam蛋白结构域分析、SMART蛋白结构域分析、TF分析、TMHMM跨膜螺旋结构分析、信号肽预测等

c) 结构分析：串联重复单元分析、可变剪切分析、LncRNA分析

拟穴青蟹三代全长转录组测序

合作单位：集美大学

发表期刊：Scientific Reports

影响因子IF：4.011

研究样本

健康性成熟的雄性和雌性拟穴青蟹各4只，采集12种不同组织（鳃、肝胰脏、肌肉、脑神经节、眼肌、胸神经节、肠、心脏、睾丸、卵巢、精巢和血细胞）混合后测序。

研究结果

文章先提取样本中RNA进行建库，对得到的全长序列进行去冗余聚类，并用非全长序列对其进行校正，得到全长转录本，对序列结果进行评价，共获得了79,005个高质量unique转录本。然后用Nr、SwissProt、COG/KOG、GO、KEGG数据库进行蛋白和基因功能注释。之后进行了一系列基因的结构分析，包括对没有注释到的转录本鉴定lncRNA，以及用转录本鉴定SSR。结果发现大多数SSRs为二核苷酸重复序列（58.53%）（图1A）。

在二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸重复序列中，AC/GT、AAT/ATT和AAAT/ATT分别是最主要的模式。随后又在可变剪切的分析中发现，转录组存在7种不同的剪切类型，保留内含子（RI）是可变剪切的主要类型，占到了50%以上（图1B）。还对基因的isoform进行了分析，结果表明一些基因的isoform甚至超过10种。

图1 (A) SSR分布图。(B)为拟青蟹转录组中可变剪切的统计。

参考文献：

Wan, Haifu, et al. "The Single-molecule long-read sequencing of Scylla paramamosain." Scientific reports 9.1 (2019): 1-11.

020-39341079